原位杂交技术（ISH）的原理与应用

1. 技术概述

原位杂交（In Situ Hybridization, ISH） 是一种分子生物学技术，用于在细胞或组织样本中**定位特定核酸序列（DNA或RNA）**的位置。它通过核酸互补配对原理，使标记的探针与目标序列结合，从而在显微镜下可视化检测基因表达、染色体异常或病原体感染等。

2. 基本原理

原位杂交的核心是核酸杂交，即单链探针与目标核酸（DNA/RNA）通过碱基互补配对（A-T/U，C-G）形成稳定的双链结构。其关键步骤包括：

（1）样本制备

固定：用甲醛或多聚甲醛固定组织/细胞，保持核酸完整性。

通透化：用蛋白酶K或去垢剂处理，增加探针穿透性。

（2）探针设计与标记

探针类型：

DNA探针（用于检测DNA或RNA）

RNA探针（cRNA）（特异性更高，适用于RNA检测）

寡核苷酸探针（短链，适用于高分辨率检测）

标记方法：

放射性标记（如32P，高灵敏度，但安全性低）

非放射性标记（如地高辛、生物素、荧光标记FISH）

（3）杂交反应

探针与目标核酸在适宜温度（通常37-42℃）和缓冲液条件下孵育，形成特异性结合。

（4）信号检测

放射性标记：通过X光胶片或磷屏成像。

荧光标记（FISH）：直接显微镜观察荧光信号。

酶标检测（如DAB显色）：用于光学显微镜观察。

3. 主要类型

4. 技术优势

✔ 高特异性：探针可精确匹配目标序列，减少假阳性。

✔ 空间定位：保留组织/细胞结构，直观显示核酸分布。

✔ 高灵敏度：可检测低丰度RNA或单拷贝基因。

✔ 多模式检测：兼容荧光、显色、放射性标记。

5. 典型应用

（1）基础研究

基因表达定位（如胚胎发育、脑神经RNA分布）

非编码RNA（lncRNA、miRNA）功能研究

（2）临床诊断

肿瘤学：HER2、EGFR基因扩增检测（指导靶向治疗）

遗传病：染色体异常（如21三体综合征）

病原体检测：HPV、EB病毒原位检测

（3）农业与生物技术

转基因作物外源基因整合位点分析

动植物育种中的染色体鉴定

原位杂交技术是连接分子生物学与形态学的重要工具，广泛应用于科研、临床和工业领域。随着多重FISH（如MERFISH）、超分辨率成像等技术的发展，其应用潜力将进一步扩大。

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